这次新型病原如何被发现的？mNGS首功！

最原先取而代之型冠状狂犬病是如何被发在现的？宇测序PCR（mNGS）首当其功！当年SARS，坚称过支原体、病菌、狂犬病等接种，最后折腾了很久下才发在现是冠状狂犬病接种。如今mNGS问世，改变了狂犬病有机常为学的病因取而代之格局！这次从发在病到病因，只有短短几天时间！上面就简单介绍一下mNGS.

已经有三十年，组学研究工作一直是近来，年所是测序学，然后是蛋白质组学，如今取而代之兴组学领域则是被认为众所周知充满信心的宇测序学（Metagenomics）。宇测序学（Metagenomics）又叫有机常为自然环境测序学、元测序学，通过实际上从自然环境样品里面萃取全部有机常为的DNA或RNA，构建宇测序文库，利用测序学的研究工作策略研究工作自然环境样品所包含的全部有机常为的遗传都由、栖地特官能，并可整合原先心理活官能常为质（或获得取而代之基因组）。

2014年取而代之英格兰篇文章报道了一个通过宇测序主要用途测定康复了一位状况不明、间歇发在热、具有癫痫及脑积水症状的14岁**的案例，这是历史上首个宇测序流行病学应用顺利的案例。文章报道这个正因如此化疗及狂犬病筛选都没有确诊状况，随后对胎盘抽取mNGS筛选，结合生常为的资讯学研究工作结果发在现一种出事的致病菌leptospira infection，随后针对官能地用于布洛芬和头孢吡肟化疗后出院。该团队推定这是一种尚未报道过的狂犬病有机常为。由此，流行病学宇测序年底应可用有机常为病因拉开了紧接著。详尽见：NEJM：同类型PCR技术开发在危在旦夕危重病**

随着基因组PCR技术开发在的迅猛发在展，基于二代PCR的宇测序学（宇测序PCR）视作了流行病学的话题。宇测序PCR（mNGS）是整体研究工作来自患者抽取的有机常为和寄主的基因组常为质（DNA和RNA）的研究工作方法，应可用多种接种官能营养不良的病因、营养不良和健康状态下有机常为学研究工作、本能寄主加成对接种传播的形态化、识别肿瘤方面狂犬病。宇测序PCR（mNGS）描述了抽取里面存在的所有DNA或RNA的资讯，从而能够研究工作整个有机常为组以及患者抽取里面的本能寄主测序或激活组，让致病有机常为无所遁形。

在流行病学接种官能微生常为找寻的每一次里面，流行病学医师经常都会面对取而代之发在微生常为往往想不到、多事接种微生常为没想到、或者由于测定技术开发在受限想到没测定到的困境，除此以外的流行病学主要用途病因方式与流行病学的迫切期望之间还存在着巨大的鸿沟。而mNGS (宇测序学二代PCR技术开发在) 在“理论上”能够知道道流行病学医师的上述当下，现阶段官能已解决流行病学接种官能营养不良诊治的大部分困难。

mNGS作为一种不均需培育的取而代之型技术开发在，可以深入迅速检验接种微生常为，相比传统文化培育研究工作方法以外很高敏感度的同时又与“精准诊疗”的理念相充分体现。Gyarmati 等在2016年发在表的一篇文献里面指出，mNGS可以实际上从体液抽取里面检验不必培育的、苛养的以及非病菌 (狂犬病和霉菌) 微生常为。除此之外，mNGS可以可用传染病卫生保健，具有实际上从流行病学抽取里面获的微生常为传播来龙去脉的潜能。2014年，Hasman等指出mNGS可可用尿液抽取里面微生常为以及耐药基因组的测定，而且不仅耐药基因组的测定结果与药敏测试恰当，也与基于纯培育常为的全测序PCR (WGS) 的演化出研究工作结果相匹配。越来越多的案例以及流行病学研究工作指出mNGS可用流行病学病因的可行官能以及诸多优势，使得mNGS视作理想微生常为病因研究工作方法的“热门候选人”。

mNGS有哪些用途呢？

上面这张图很好地概括和知道明了。二代PCR不仅可以可用狂犬病学测定，也可以在狂犬病培育后做深的二代PCR，甚至全测序研究工作。现在主要可用流行病学的还是流行病学推测地狂犬病学测定，通过测定可以知道推测地里面含有的微生常为。如果PCR量能够进一步冲破，它除了可以把推测地里面里所有有机常为的核苷酸测出来外，也可以把化学物质表达的所有RNA测出来，帮助判断定植或者接种。比如圣诞树实为单胞菌测出来后，化学物质有没有针对它产生炎症加成，还可以判断是定植还是接种，但现今还在揭示阶段官能，尚正因如此未可用流行病学。

对于混合接种，mNGS也有天然的优势

对于混合接种的病因，与传统文化研究工作方法相比，NGS具有很高的敏感度。

然而，在踏上光明坦途，为流行病学包括“服务中心”解决方案之前，mNGS仍有一段开阔小路均需艰难继续前进。首先，面对体液、脾液、胎盘、组织、拭子等纷纷杂杂的推测地连续官能，如何建立统一的核苷酸萃取标准使得微生常为的测定效能更高困难重重。寄主核苷酸也是干扰微生常为测定的便是状况，在核苷酸萃取即场，怎么样做到理论上替换成寄主核苷酸，硫化物微生常为核苷酸，进而提高mNGS的敏感度也是困扰之一。

在PCR即场，如何依据关注的微生常为连续官能选项合适的PCR策略？如何优劣PCR深、交付时间以及所均需金融业生产成本等诸多状况？这些疑虑依然是现阶段官能接踵而来的巨大的单打独斗。

另外，在测试即场申请加入质控抽取不可或缺。理想的质控应适可用相同接种症候群以及对应的各种抽取连续官能，涵盖非典型质控、复数质控以及申请加入狂犬病体或纯DNA的人工模拟质控抽取。然而，mNGS年初伸展的研究工作方法学连续官能为选取何种狂犬病体作为非典型质控增加了难度，流行病学实践里面又该如何获取经过道德上审批的大批量复数相符合抽取也是疑虑之一。

在生常为的资讯总体，近来有研究工作检验了相同的生信研究工作研究工作方法的优劣。除此以外的研究工作方法不仅正则表达式存在相异，而且所用的元数据也各有相同，避免在微生常为检验能力以及相比之下轻元素量化总体消失差别。在mNGS生信研究工作流程缺乏统一标准的情况，用于者基于个人成果、可及官能以及简便官能换用生信研究工作该软件，都会对测试重复官能以及结果通用官能造成严重影响，视作mNGS的流行病学标准化障碍。

因此，该研究工作全面官能关注核苷酸萃取和生常为的资讯研究工作两个重要即场，对比检验三个人源寄主替换成试剂盒 (Ultra-Deep Microbiome Prep 、QIAamp DNA Microbiome Kit、Micro-DXTM) 以及多种除此以外商用或非商用生常为的资讯用以的优劣。

科学界采集9个体液 (腹膜液、脓液、关节液、脾液) 抽取和1个骨组织推测地进行PCR，之后分别用于相同的生常为的资讯该软件比如基于Unix的系统 (Kraken、Metaphlan2和MIDAS)、基于网址版的商用或非商用 (BaseSpace、Taxonomer和CosmosID) 研究工作该软件与商用工作站 (CLC genomics Workbench)。他们发在现相同抽取的下机权重及人源碱基占比相异相当大 (3.5%-98.9%)，其里面人源占比与抽取连续官能无关，与每个抽取自身的连续官能以及去寄主试剂盒的高效率有关。

本文章涉及的mNGS生信研究工作该软件

以培育或MALDI-TOF为金标准，科学界检验量化了每种研究工作该软件的微生常为检验取值以及其对应的非典型、实为非典型、敏感度等常量。在流行病学实践里面，取而代之技术开发在均需要同时具备具有高敏感度和高非典型假设 (PPV)。用于Kraken和Taxonomer这两个流行的该软件可以看见其测定到数十到数百种有机常为，量化获得的PPV极低。虽然设阈值过滤对解决这一疑虑有益，但阈值究竟设为多少仍存在争论里面。另外，该软件均需整体用于多个常量，如相比之下轻元素、测序大小、测序伸展率等主要用途狂犬病体的检验。

科学界也在复数质控抽取里面检出1%的人驼背杆菌，他们研究工作驼背杆菌的检出或许是自然环境或抽取间的污染、PCR试剂扩展或生常为的资讯研究工作的杂乱鉴别等状况避免。氛围菌的疑虑也在多个研究工作里面被提及，这些检出的微生常为在抽取里面是否真实存在？污染、定植还是致病如何区分开？技术开发在生产在其他部门，生常为的资讯其他部门、有机常为专家以及流行病学医师也接踵而来着大大更新的单打独斗。总结知道来，现今mNGS的流行病学应用接踵而来如下四个单打独斗：

面对如上的单打独斗，我们也遇到了一系列的当下。译者本期找寻了两个关于mNGS流行病学专家常都会问到的疑虑，从现阶段官能技术开发在发在展的角度启航在，给出如下的尝试官能解答。

为什么有些抽取培育非典型了、核苷酸测定非典型了、mNGS没有检出来？这个技术开发在看看敢？

任何流行病学测定都要优劣卫生金融业生产成本，这也是取而代之技术开发在mNGS的考量状况之一，使得现今mNGS金融业生产成本与敏感度之间均需要优劣。流行病学抽取具有相当高的复杂官能，而且很多微生常为接种后含量很低或用药后取样避免狂犬病数量降低，在限定权重的情况，靶狂犬病由于的资讯太少而被被盗。

由于这些单打独斗带来的测定上都，往往就都会促使流行病学医师形成重新认识上都，所以我们听到流行病学医师对mNGS特官能的不认可的声音。虽然扩大权重是手段之一，但在卫生金融业生产成本的限定下总有持续官能。通过硫化物狂犬病体，减小PCR权重，进而提高敏感度；测定稍长影片，进而提高特异官能是我们与流行病学现今以及未来共同努力的方向。

流行病学医师经常反馈mNGS测定结果是一个微生常为此表，到底哪个或哪几个狂犬病才是主因？

多个狂犬病的检出主要如下两个总体状况：

mNGS技术开发在正则表达式存在短碱基杂乱鉴别，特别是在针对大部分关联官能低的常为种，因此其在这类关联官能低的常为种里面分类意义就打了折扣。如何解决一个短碱基同时比较到多种微生常为疑虑呢？现今我们的生产在其他部门正在迅速的整合形态基因组元数据，多取值据库的启用才都会进一步提高狂犬病体的准确鉴别能力。

多狂犬病共接种、 原发在接种与继发在接种的多狂犬病接种或呼吸道分泌常为，消化道分泌常为开放体系本身的有机常为动植常为等状况才都会避免多种微生常为检出。这实际上不是技术开发在本身上都，而是儿科疑虑。培育研究工作方法、质谱研究工作方法、多重PCR研究工作方法也都会检出多个微生常为，最终的病因结论均需要有流行病学病因的方面的资讯介入、也均需要流行病学接种医师的共同进行，不必依靠测定解决一切疑虑。在充分其他部门编制报告的情况，多微生常为此表示范的优势作用在于一总体包括或许的理论上来龙去脉，另一总体当有准确清晰的流行病学的资讯时可以主要用途流行病学病因。

对于mNGS来知道，可以知道为狂犬病学病因又锁住了一扇原先窗户，我们一定要巧妙的实践，要重新认识到它的优势和好处，但是拿到结果时要小心反驳，掌握取而代之前沿。

原始出处：

Couto, N., Schuele, L., Raangs, E. C., Machado, M. P., Mendes, C. I., Jesus, T. F., ... Wild Autenrieth, I. B. (2018). Critical steps in clinical shotgun metagenomics for the concomitant detection and typing of microbial pathogens. Scientific reports, 8(1), 13767.

Gyarmati, P. et al. Metagenomic analysis of bloodstream infections in patients with acute leukemia and therapy-induced

neutropenia. Sci. Rep. 6, 23532 (2016).

Hasman, H. et al. Rapid whole-genome sequencing for detection and characterization of microorganisms directly from clinical